科研 | Redox Biology： 脂肪酸氧化障碍的线粒体形态、生物能量学和蛋白质组学反应

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编译：微科盟大陈子，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。

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导读

编码线粒体蛋白超长链酰基辅酶A脱氢酶（VLCAD）和线粒体三功能蛋白（TFP）的核基因突变导致罕见的常染色体隐性遗传疾病。我们对VLCAD和TFP突变患者来源的成纤维细胞进行研究并发现细胞线粒体缺陷。为了深入了解导致线粒体缺陷的病理变化，我们对来自三种不同VLCAD和三种不同TFP突变的受试者的成纤维细胞进行了定量蛋白质组学、生化和形态计量学分析。经抗体检测证实的蛋白质组学数据表明，VLCAD和TFP突变细胞中VLCAD和TFP蛋白水平分别降低，这在一定程度上解释了脂肪酸氧化能力降低的原因。结果表明，在葡萄糖去除后，VLCAD和TFP突变细胞线粒体呼吸容量下降，TFP突变细胞糖原水平较低。尽管存在这些能量缺陷，但VLCAD和TFP突变的细胞在线粒体形态、分布、融合和裂变方面没有表现出变化，这些变化可以通过共聚焦或透射电子显微镜进行量化，并通过蛋白质组学和基于抗体的蛋白质分析得到证实。VLCAD成纤维细胞和TFP突变细胞线粒体呼吸链蛋白和促进呼吸复合体组装的蛋白水平增加。除了TFP突变细胞中过氧化氢酶和谷胱甘肽S-转移酶θ-1水平降低外，VLCAD和TFP突变细胞与非疾病对照组之间所有主要细胞内抗氧化网络中45种蛋白质的水平相似。总体数据表明，尽管存在代谢缺陷，但携带VLCAD和TFP突变的细胞仍能保持蛋白质组的完整性，以保护细胞和线粒体的结构，支持能量生产，并保护氧化应激。

论文ID

原名：Mitochondrial morphology, bioenergetics and proteomic responses in fatty acid oxidation disorder译名：脂肪酸氧化障碍的线粒体形态、生物能量学和蛋白质组学反应
期刊：Redox Biology
IF：9.986发表时间：2021.05通讯作者：Harry Ischiropoulos
通讯作者单位：美国宾夕法尼亚大学

实验设计

实验结果

1. 非疾病和突变原代人成纤维细胞中LCFA氧化通路的评估
本研究使用了来自非疾病对照1和2的早期传代人皮肤源性成纤维细胞，以及三种不同VLCAD突变和三种不同TFP突变的受试者(一种α突变，两种β亚基突变)(补充图S1)。我们利用[9，10-³H ]棕榈酸酯通量实验证实VLCAD和TFP突变的细胞氧化棕榈酸酯的能力显著低于非疾病对照成纤维细胞(图1A )。采用线粒体转运体肉碱O -棕榈酰基转移酶1α(CPT1α)的抑制剂etomoxir预孵育成纤维细胞后，棕榈酸酯在所有细胞中的流通量均降低，表明大部分活性是由线粒体脂肪酸氧化产生的(图1A )。棕榈酸盐通量主要取决于大约25种蛋白质的水平和活性，其中一些相对稳定。我们在蛋白质组学研究中，对22种参与LCFA氧化的蛋白水平进行了量化(图1B和补充数据文件1)。VLCAD突变细胞的VLCAD蛋白水平显著降低；质谱分析结果显示，突变系中VLCAD蛋白的平均水平为非疾病对照的11%，而Western blot分析结果为10% (图1C，补充图S8)。除VLCAD外，在VLCAD突变的细胞中，我们检测到长链脂肪酸转运蛋白1、长链脂肪酸辅酶a连接酶1、肉碱O -乙酰转移酶、短链特异性酰基辅酶a脱氢酶和3-酮酰基辅酶a硫代酶水平显著下降。(图1 B)。TFP β链(T2)和(T3)突变的细胞中，TFA α或β亚单位水平降低。c.1528 G > C α-亚单位TFA突变( T1 )的成纤维细胞中TFA α或β亚单位水平与对照组无明显差异(图1C )。在VLCAD和TFP突变的细胞中，蛋白质组学或Western blot均未检测到这一代谢途径的其他蛋白，包括长链和中链酰基辅酶a脱氢酶(LCAD, MCAD)和CPT1α(图1C和补充图S2)。由于局限于线粒体外膜的CPT1α水平没有改变，我们用抗CPT1α抗体染色细胞后，通过共聚焦显微镜评估线粒体形态。我们对每个细胞系进行3-6次独立实验，并且获得相同强度的细胞荧光。CPT1α染色显示典型的线粒体网络形态和分布在非疾病细胞以及VLCAD和TFP突变细胞中(图1D和补充图S3)。荧光强度的定量并没有显示非疾病对照组与VLCAD或TFP突变细胞之间的显著差异(图1D)。这些数据表明，VLCAD突变的细胞不仅会降低VLCAD水平，还会增加参与LCFA氧化的蛋白。β亚单位TFP突变的细胞TFP水平较低。蛋白质水平的降低部分解释了氧化LCFA能力的降低。然而，VLCAD和TFP突变的细胞似乎具有正常的线粒体形态。为了进一步探究线粒体在突变细胞中的作用，我们对线粒体的功能和动力学进行了量化。 图1 非疾病和突变原代人成纤维细胞中LCFA通路的评估
A，[9,10-³H]棕榈酸酯在无或存在10μM依托莫西的情况下在非疾病对照和突变的原代成纤维细胞中的氧化，量化为每毫克蛋白质每小时被氧化的棕榈酸酯的pmol。以非疾病成纤维细胞系1和2为对照（材料和方法）。B，通过蛋白质组学分析，描绘了参与LCFA氧化的蛋白质相对水平的变化(log2倍变化)。蛋白质组学分析量化并比较了非疾病对照组1、2和3与VLCAD或TFP突变细胞蛋白相对水平的变化。这些蛋白质根据生物学功能（1）LCFA转运到细胞并激活到LCFA酰基辅酶A，（2）LCFA酰基肉碱的产生并转运到线粒体，（3）β-氧化和（4）辅助蛋白质进行聚类。C，具有代表性的western blot，原始印迹如图补充图S8-9所示。以及western blots相对蛋白水平的密度定量。数据用单向方差分析表示为平均SD、n=3、**P<0.01、***P<0.001和****P<0.0001。细胞内运输、活化、线粒体转运、β-氧化、肉碱梭和辅助蛋白。D，具有代表性的CPT1α抗体染色细胞共聚焦荧光图像，以显示线粒体。对于抗cpt1 α荧光强度的定量，我们分析了3-6个独立实验，其中TFP 2和TFP 3的16张图像和其余细胞系的38-44张图像进行了定量。 2. 线粒体功能:呼吸和钙处理
线粒体耗氧量采用Oroboros O2K高分辨率呼吸仪测定。通过典型的抑制剂解偶联剂方案，我们量化了在葡萄糖培养基中培养细胞后1h的基础耗氧量、与ATP产生相关的呼吸、最大呼吸和非线粒体耗氧量，以揭示氧化磷酸化的潜在缺陷。具有VLCAD和TFP突变的成纤维细胞，除了具有纯合c.364A>G VLCAD突变（V1）的细胞外，显示基础线粒体呼吸减少（图2A）。除364A>gvlcad突变（V1）和纯合c.182G>Aβ亚单位TFA（T3）突变的细胞减少质子渗漏外，质子渗漏与对照组无差异。887 - 888缺失和外显子18剪接( V2 )的VLCAD细胞以及c . 1528G > Cα亚基TFA突变( T1 )和c . 182G > Aβ亚基TFA突变( T3 )的细胞最大呼吸容量降低，线粒体呼吸改变导致T1和T3细胞ATP生成降低(补充图S4 )。这些发现在一定程度上与之前关于VLCAD和TFP突变的人成纤维细胞的报道一致，并指出了氧化磷酸化的潜在不足。在缺乏外源性葡萄糖的情况下，细胞可以将储存的糖原转化为葡萄糖，从而产生ATP，并在应激下维持较低的细胞环境。我们量化了葡萄糖去除后的糖原水平。与非疾病成纤维细胞相比，TFP突变细胞的糖原水平较低(图2D)。TFP突变细胞中的糖原沉积水平较低，可能表明这些细胞对葡萄糖的需求和利用增加，以满足能量需求。在VLCAD或TFP突变的细胞和非疾病对照组的成纤维细胞中，参与糖酵解、丙酮酸代谢和TCA周期的74个蛋白水平相似(补充数据文件1)。然而，我们在蛋白质水平上发现了一些变化。与对照组相比，VLCAD细胞中β和γ烯醇化酶水平降低，而TFP突变细胞中β烯醇化酶水平降低，暗示磷酸烯醇化丙酮酸产量可能减少。VLCAD和TFP突变的细胞中，2-氧戊二酸脱氢酶复合物的二氢脂酰胺琥珀酰转移酶(E2)成分水平降低，E2可催化2-氧戊二酸转化为琥珀酰辅酶a和CO₂。VLCAD突变的细胞也降低了2-氧戊二酸脱氢酶E1组分的水平，表明琥珀酰辅酶a的产生可能减少。蛋白质组学分析量化了63个线粒体电子传递链(ETC)蛋白和16个复合物V (ATP酶)蛋白的水平。在VLCAD突变的细胞中，NADH:泛素氧化还原酶复合物I中的8个蛋白、泛素细胞色素c还原酶复合物III中的1个蛋白和1个ATP酶蛋白的水平升高(图2E)。此外，蛋白质组学分析还表明，支持和促进ETC组装和线粒体内膜组织的蛋白水平显著增加。在VLCAD突变的细胞中，琥珀酸脱氢酶(SDHAF4)、复合物III (LYRM7)和细胞色素c氧化酶(COA4, COX17)装配因子的相对水平显著升高(补充图S5和补充数据文件1)。此外，在VLCAD突变的细胞中，MICOS结构完整的MICOS复合体亚基60亚型4、MICOS复合体亚基10的水平增加了2倍(补充图S5和补充数据文件1 )。在TFP突变的细胞中，LYRM7、COX17和MICOS复合体亚基25水平升高(补充图S5和补充数据文件1 )。对50种促进线粒体组织和功能的蛋白的定量研究显示，VLCAD或TFP突变细胞与非疾病对照组细胞之间的水平相似(补充数据文件1)。在线粒体钙转运方面，VLCAD突变的细胞中m - AAA蛋白酶相互作用蛋白1和钙结合线粒体载体蛋白SCaMC - 1的水平略有下降 (补充数据文件1 )。然而，VLCAD突变的细胞线粒体质子/钙交换蛋白水平显著升高。另外13种参与线粒体钙调控的蛋白水平在VLCAD突变细胞和对照组之间没有差异。所有16种参与钙调控的蛋白水平在TFP突变细胞和非疾病对照组细胞之间是相似的(补充数据文件1)。 图2 非疾病和突变原代人成纤维细胞的线粒体呼吸
A-C，在培养基中没有葡萄糖的情况下，用高分辨率呼吸测定法定量线粒体耗氧量。A.基础呼吸，B.质子泵泄漏率，C.最大呼吸。数据描述为平均SD n=3个不同的细胞制备。*P<0.05，**P<0.01，通过单因素方差分析与对照非疾病细胞相比。为了确保差异不仅仅是与一个对照非疾病系的比较，我们证实了与对照1相比，另外三个对照成纤维细胞的线粒体耗氧量在统计学上没有差异（补充图S4）。D，糖原水平的稳态定量。从培养基中去除葡萄糖后1h，对糖原进行定量。*P<0.05，**P<0.01，通过单因素方差分析与对照非疾病细胞相比。非疾病对照成纤维细胞1的糖原水平与其他三个非疾病对照成纤维细胞相似（补充图S4）。E，描述ETC蛋白相对水平变化的热图。*P<0.05 VLCAD组与对照组间差异蛋白质水平***P<0.05 TFP组与对照组间差异蛋白质水平。 3.抗氧化网络和应激反应
先前的研究表明，VLCAD和TFP突变的成纤维细胞中氧化剂的产量增加。在线粒体、细胞质和其他细胞室中，氧化剂的产生增加了，细胞承受氧化还原稳态变化的能力部分是由抗氧化蛋白网络决定的。蛋白质组学研究提供了一个平台来评估所有主要抗氧化网络中的蛋白质水平，而不是单个的蛋白质。44种细胞内抗氧化蛋白的水平，包括超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶、硫氧还蛋白和过氧化物还蛋白，在VLCAD和TFP突变的细胞和非疾病对照组的成纤维细胞之间是相似的(补充图S5和补充数据文件1)。VLCAD突变细胞胞外SOD水平显著降低，TFP突变细胞过氧化氢酶和谷胱甘肽S-转移酶theta-1水平显著降低。戊糖磷酸途径是NADPH的重要来源，它为抗氧化系统和多种生物合成途径提供电子。除GDH/6PGL内质网双功能蛋白外，葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶和其他四种戊糖磷酸途径的主要酶的水平在VLCAD或TFP突变细胞和对照组之间没有差异。VLCAD和TFP突变的细胞中，GDH/6PGL内质网双功能蛋白水平降低，暗示内质网(ER)氧化环境中可能缺乏NADPH的产生。我们还量化了18种参与线粒体应激反应的线粒体蛋白的水平，包括Lon蛋白酶，它降解氧化修饰的多肽和调节线粒体DNA复制。VLCAD突变细胞的多功能周期蛋白依赖性激酶1水平降低，TFP突变细胞的蛋氨酸- R-亚砜还原酶B2的异构体-2水平升高，这是一种催化蛋氨酸亚砜转化为蛋氨酸的酶。与非疾病对照组的成纤维细胞(补充数据文件1 )相比，VLCAD和TFP细胞无其他明显变化。 4. 线粒体动力学:融合，分裂，线粒体吞噬和分布
融合、分裂和线粒体自噬是线粒体发生、形态和功能的关键生化过程。基于质谱的蛋白质组学分析量化了17种参与融合、分裂和线粒体自噬的主要蛋白和8种调节线粒体在细胞内运动和分布的蛋白的水平(图3A)。VLCAD或TFP突变细胞与非疾病对照组的成纤维细胞之间参与融合和分裂的蛋白相对水平没有定量差异(图3A)。融合介质mitofusin-1(MFN1)和mitofusin-2(MFN2)以及促裂变动力相关蛋白1 (DRP1;也被称为DNM1L，在UniProt蛋白知识库中是dynamin-1样蛋白)。与蛋白质组学数据一致的是，在VLCAD或TFP突变的细胞中，与非疾病对照组细胞相比，这三种GTPases的相对水平没有检测到差异(图3B，补充图S10中的原始印迹)。除了VLCAD突变细胞中自噬相关泛素样修饰因子(MAP1LC3B)增加外，非疾病对照组与VLCAD和TFP突变细胞中调控线粒体自噬的蛋白水平相似。在VLCAD突变的细胞中，微管相关蛋白1B水平升高，含有重复的x -连锁蛋白3水平降低，当降解时，它调节线粒体分布。在VLCAD和TFP突变组与非疾病对照组之间，我们没有发现其他协调线粒体分布的蛋白水平差异。细胞也被MFN1抗体染色，MFN1定位于线粒体外膜，有利于线粒体聚集和融合。MFN1染色显示典型的线粒体网络形态和定位。荧光强度的定量并没有显示VLCAD或TPF突变细胞与非疾病对照组的成纤维细胞之间MFN1水平和定位的变化(图3C和补充图S3)。这些数据表明，VLCAD或TFP突变的细胞在调控线粒体形态和分布的主要生化过程中没有明显的缺陷。 图3 线粒体融合和分裂的评估
A，参与线粒体融合、分裂、有丝分裂吞噬和线粒体定位的蛋白质组学定量。*P<0.05，VLCAD和TFP组与对照组的蛋白质水平存在差异。B，代表性蛋白质印迹（原始印迹如补充图S10所示）和MFN1/2和DRP1的定量。促进线粒体融合（MFN1/2）和分裂（DRP1）的蛋白质在非疾病（对照组）和突变的原代成纤维细胞之间的相对水平没有显著变化。数据用平均标准差表示，n=3。C，用抗MFN1抗体染色细胞的代表性共焦荧光图像，以可视化和定量线粒体网络。对于抗MFN1荧光强度的定量，进行了4个独立实验，并从T2、T3的20个图像和其余细胞系的26-28个图像中获得定量。 5. 非疾病和突变的原代人成纤维细胞的线粒体形态
为了进一步探索细胞和线粒体形态的变化，我们对肌动蛋白丝进行免疫荧光，用Mito tracker green对活细胞进行染色，并使用透射电镜观察。我们采用鬼笔环肽对肌动蛋白丝进行染色，观察细胞形态和细胞骨架结构，显示出典型的成纤维细胞骨架形态。在所有成纤维细胞中，phalloidin的平均强度相似，表明细胞骨架结构的保存（补充图S3）。用Mito-tracker green评估的VLCAD和TFP突变细胞的线粒体定位和质量与对照组相似，支持CPT1α和MFN1的成像研究，线粒体形态无明显扰动。透射电子显微镜（TEM）和图像的形态计量学分析用于评估线粒体和细胞内形态（图4）。与非疾病对照的成纤维细胞相比，每个细胞系10张图像的形态计量学定量未检测到具有VLCAD和TFP突变的成纤维细胞中线粒体平均长度的变化（图4）。由于VLCAD和TFP突变的细胞可能降低了内质网NADPH水平，我们量化了内质网所占的体积以及内质网和高尔基体的膨胀。与非疾病对照组相比，在VLCAD或TFP突变的细胞中，这些形态学参数没有显著差异(补充图S6)。TEM图像显示糖原颗粒呈大致圆形，我们用生化方法对其进行了定量(图4)。TEM图像的另一个特征是存在液泡，这可能表明脂肪堆积。我们用尼罗河红对脂滴进行染色。细胞染色定量显示存在脂质沉积，但对照组与VLCAD或TFP突变的细胞之间没有显著差异(补充图S6)。总的来说，EM数据与荧光成像一致，线粒体和细胞结构没有明显的扰动。 图4 线粒体TEM图像和形态学定量
A，非疾病和突变的原代人成纤维细胞的代表性TEM图像。B，TEM图像的形态学分析，在25倍放大下，从每个细胞系的10张图像中定量线粒体的长度。数据描述为平均±SD n = 3个独立细胞培养。 6. 全蛋白质组和线粒体蛋白质组的改变
与非疾病对照的成纤维细胞相比，基于质谱的分析量化了VLCAD突变细胞5041个蛋白质和TFP突变细胞4786个蛋白质的相对水平。VLCAD突变细胞比TFP突变细胞表现出更大的蛋白质组学差异，与非疾病对照相比。VLCAD突变系和非疾病对照之间的601个蛋白质相对水平不同，占定量蛋白质组的12%，而TFP和对照之间的266个蛋白质相对水平不同，占定量蛋白质组的6%。（p<0.05，图5A和D以及补充数据文件2）这些差异在火山图中进行了描述，这些火山图描述了具有统计意义的蛋白质数量以及相对水平减少或增加超过2倍的蛋白质数量（图5A和D以及图5B和E中蛋白质的定量）。在601个蛋白质中，78个蛋白质水平下降，63个在VLCAD突变细胞中增加了2倍以上（图5B）。在TFP突变细胞中，266种蛋白质中，33种蛋白质的相对水平降低，40种蛋白质的相对水平升高，变化超过2倍（图5E）。VLCAD突变细胞相对水平显著降低的蛋白质的基因本体分析显示代谢过程减少（补充数据文件2）。在同一细胞中，水平相对升高的蛋白质在参与细胞组织或生物形成的途径中被功能聚集，特别是线粒体呼吸链的组装和呼吸（补充数据文件2）。TFP突变细胞中的类似研究表明，参与细胞组织、膀胱转运和代谢的蛋白显著降低，而水平升高的蛋白质参与RNA代谢和肌动蛋白丝的生物学过程。VLCAD和TFP突变的细胞共有115个核心蛋白，与非患病对照组相比，这些核心蛋白在统计学上存在差异。VLCAD和TFP中115个蛋白中有93个蛋白相对水平升高，14个蛋白相对水平降低，8个蛋白不一致。这93个蛋白对RNA结合蛋白以及定位于局部黏附和锚定连接的蛋白具有共同的功能富集(补充数据文件2 )，表明适应性改变优先于细胞结构完整性。这种蛋白质组学的适应性是明显的，在VLCAD和TFP突变的细胞中，微丝切割蛋白的水平增加了5倍以上，微丝切割蛋白是一种钙依赖的肌动蛋白丝切断蛋白，调节细胞骨架动力学。VLCAD突变的细胞中largen的水平增加了6倍以上，largen是一种调节线粒体和细胞大小的蛋白质。具有TFP突变的细胞具有更高水平的E3泛素连接酶F-box-only蛋白40和shromm-3，它们调节细胞形状。我们利用新发布的Mitocarta 3.0对蛋白质组学数据进行分析，以筛选线粒体蛋白，mitocarta3.0是一份1136个人工整理的人类线粒体蛋白质的详细目录。基于Mitocarta 3.0，我们分别定量了VLCAD和TFP突变细胞中的639和585个线粒体蛋白。此外，我们通过将细胞蛋白质组提交到基因本体(GO)知识库，并使用细胞成分搜索法提取线粒体分配的蛋白质，生成了一个线粒体蛋白质的补充清单。最终的列表是使用UniProtKB蛋白数据库中作为线粒体注释的1213个人类蛋白的最新列表进行管理的，并手工检查，只包括在生理条件或压力下有线粒体定位证据的蛋白。这导致VLCAD和TFP突变的细胞中分别增加了50和48个蛋白。综上所述，我们分别定量了VLCAD和TFP突变细胞中所有主要功能通路中689和633个线粒体蛋白的水平(补充图S7和补充数据文件2)。与整个蛋白质组相似，与非疾病对照组相比，有VLCAD突变的细胞中线粒体蛋白的14%(58个减少，46个增加)显著不同。在TFP突变的成纤维细胞中，只有4%的线粒体蛋白(12个减少，13个增加)存在显著差异(图5C和F)。具有VLCAD突变的细胞中相对水平降低的线粒体蛋白质显示脂肪酸分解代谢过程的功能簇的预期减少（图1和补充数据文件2）。另一方面，VLCAD突变体细胞中水平增加的线粒体蛋白质被富集，用于与线粒体组织等相关的生物过程和ETC复杂组装（图2和补充数据文件2）。这些数据与生化和形态学分析一致，表明尽管存在代谢缺陷，但VLCAD突变细胞和TFP突变细胞表现出适应性的蛋白质组学变化，旨在维持细胞和线粒体的结构。 图5 细胞和线粒体蛋白质组的变化
A和D，蛋白质组学分析量化并比较了非疾病对照组1、2和3与具有VLCAD或TFP突变的细胞中蛋白质相对水平的变化。典型的火山图整合了VLCAD突变细胞（A）和TFP突变细胞（D）与非疾病对照细胞之间的p值和幅度变化。采用log2变换、减法归一化、t检验等方法构建曲线，p<0.05。灰点表示单个蛋白质的相对水平没有显著变化。蓝点表示变化显著（t检验，p<0.05），红点表示变化显著（t检验，p<0.05）超过2倍的蛋白质。B和E，在VLCAD突变细胞(B)、TFP突变细胞(E)和非疾病对照组细胞之间，显著减少或增加的蛋白数量在蓝色中，在红色中发生2倍或更多变化的蛋白数量。C和F，线粒体蛋白使用现有的开源应用程序(Mitocarta 3.0, Uniprot知识库，GO)进行管理。数据描述了被量化的蛋白总数、线粒体蛋白的数量和线粒体蛋白在VLCAD突变细胞(C)、TFP突变细胞(F)和非疾病对照组细胞中显著不同的部分。

讨论

长链脂肪酸β-氧化病是一种常染色体隐性遗传疾病，主要影响心脏、肝脏和骨骼肌。慢性能量不足和LCFA氧化不完全产物的积累是两种主要的相互非排他的致病机制，部分解释了其临床表型。线粒体功能失调ATP生成增多，干扰线粒体网络、细胞内组织和氧化还原稳态的可能性可能被认为是导致器官衰竭的额外机制。在这里，我们通过蛋白质组学分析结合生化和形态计量学数据证实了生物能量存在缺陷，并且尽管细胞的代谢能力存在挑战，但细胞仍保持结构完整性以及线粒体形态和功能。蛋白质水平的保持和蛋白质组学的适应可能是细胞克服生物能量挑战能力的原因。VLCAD突变的细胞具有更低的VLCAD蛋白水平，除了VLCAD突变外，还导致这些细胞代谢棕榈酸酯的能力显著降低。在有VLCAD突变的细胞中，图1A所示的LCFA氧化途径中更低水平的额外蛋白也可能导致这些细胞中棕榈酸盐的通量降低。VLCAD突变的细胞也显著降低参与氨基酸代谢的2 -氧代异戊酸脱氢酶、α-氨基二苦基半醛合成酶和丙酰-CoA羧化酶α链的水平。虽然在VLCAD突变的人类中氨基酸代谢受损尚未见报道，但缺乏长链酰基CoA脱氢酶的小鼠在禁食期间发生了氨基酸代谢受损，导致低血糖。与之前的研究一致的是，VLCAD和TFP突变的细胞改变了线粒体呼吸，这在TFP突变的细胞中导致ATP的产生减少。这些线粒体生物能缺失在正常细胞培养条件下并不明显，但在应激条件下，如培养基中缺乏或存在LCFA时出现低血糖时，就会显示出来。在剥夺葡萄糖90分钟后，重新引入葡萄糖后，带有VLCAD突变的成纤维细胞比非疾病对照组细胞的糖酵解率增加，产生更多的丙酮酸和乳酸。由于乳酸和丙酮酸均增加，乳酸与丙酮酸的比例与对照组相同。同样，有TFP突变的细胞也会增加糖酵解率。然而，这些细胞产生的乳酸多于丙酮酸，因此乳酸与丙酮酸的比例增加，表明三羧酸(TCA)循环或氧化磷酸化存在缺陷。这种缺陷可能是由于TFPα链中最常见的c . 1528G > C突变和纯合的c . 182G > Aβ链TFP突变导致我们量化的细胞ATP生成能力降低。由于2 -氧代戊二酸脱氢酶复合物的水平降低导致琥珀酰-CoA水平降低，可能解释了TCA循环缺陷。尽管这一观察需要进一步研究，但它支持TCA循环中间耗竭导致ATP生成不足的假设，以满足VLCAD和TFP突变的代谢需求。这一假设在一定程度上得到了VLCAD和TFP突变受试者临床表型改善的支持，他们接受了碳链的甘油三酸酯，这些甘油三酯同时供应乙酰辅酶A和丙酰辅酶A，转化为琥珀酰辅酶A，反作用于TCA循环。尽管培养中的细胞可能不能反映患有这些疾病的受试者的能量状态，但数据部分与VLCAD和TFP缺陷受试者的代谢研究相一致。剩余的VLCAD和TFP活性以及部分过氧化物酶体的贡献似乎足以代谢静止的LCFA。然而，携带VLCAD突变的受试者并没有增加LCFA的氧化，而是依赖于糖酵解的增加来满足低强度长时间运动的代谢需求。一些携带VLCAD或TFP突变的受试者运动耐受性降低或日常活动减少，这可能与仅依赖糖酵解维持ATP生成的能力有关。我们研究比较了运动前摄入碳水化合物和中链甘油三酯(MCT)的VLCAD和TFP不足的受试者，并在这项研究中得到了证实。与碳水化合物预处理相比，MCT预处理降低了葡萄糖氧化和运动时的心脏负荷。其他研究表明，在线粒体ATP生产不足的情况下，LCFA氧化、炎症或肌纤维成分转换的不完全产物积累增加，是VLCAD突变的受试者骨骼肌运动耐受性降低的潜在机制。这也是一个可行的命题，因为本研究中使用的三种VLCAD突变的细胞保留了线粒体储备能力，增加了ETC蛋白以及促进ETC复合物组装和线粒体内膜的蛋白水平。对TFP突变者活检组织的组织学和EM评价表明，严重疾病时线粒体形态发生改变。肝活检中发现线粒体增大，脂质沉积明显。在7例常见的c.1528 G > C TFP α链突变患者中，有4例肌纤维出现线粒体体积增大，数量增多。部分线粒体肿胀，嵴扭曲。嵴正常的线粒体肿胀也很明显。萎缩性肌纤维中，形态和数量改变的线粒体更为明显。近年来，通过活细胞显微镜和基于抗体的成纤维细胞蛋白检测，我们发现8例TFPα亚基c.1528G>C突变成纤维细胞和1例c.881T>C/c.1438C>T VLCAD突变成纤维细胞的线粒体网络和融合/裂变缺陷减少。MFN2与DNML1水平的比值降低，磷酸化的DNML1与DNML1水平的比值降低，说明融合缺陷明显。动态裂变和融合过程至关重要，因为它们控制了线粒体的大小，并允许代谢产物和线粒体DNA的交换，从而确保优化的线粒体功能。尽管MFN2和DNML1对调节融合和裂变都很重要，但这些过程需要额外的蛋白质和因子共同调节这些相互作用的动力学。参与融合的6个蛋白、6个参与裂变的蛋白和调控融合与裂变平衡的dynamin-GTPase OPA1的定量分析，与对照成纤维细胞相比差异不显著。蛋白质组学数据通过基于抗体的蛋白质检测得到证实。此外，线粒体自噬、形态、转运和分布的重要蛋白水平在TFP突变细胞和对照组之间没有差异。同样，这些蛋白的水平在三种不同VLCAD突变的细胞中与对照组成纤维细胞相比没有不同。携带VLCAD突变的细胞也增加了促进管状线粒体网络、嵴组织和呼吸复合物组装的蛋白水平。TEM分析证实了这些发现，与对照组相比，VLCAD和TFP突变细胞的线粒体长度没有任何差异。此外，内质网(ER)扩张和与线粒体的相互作用的定量最近涉及调节葡萄糖稳态没有显示任何差异。

结论

总的来说，这些数据证实了VLCAD和TFP突变的成纤维细胞脂肪酸氧化和线粒体呼吸缺陷。这些代谢缺陷不影响细胞的结构和大小，以及线粒体的形态、分布、大小和功能。在某种程度上，成纤维细胞维持细胞形状、细胞内结构和线粒体形态的能力可能与适应性蛋白质组学变化有关。然而，随着疾病的进展和代谢缺陷严重程度的增加，这些适应性反应可能不足以防止线粒体形态和功能的恶化。恢复线粒体燃料利用率和代谢效率的疗法，以及去除氧化剂的分子，可能保留线粒体功能，正如在具有VLCAD突变的人成纤维细胞中所记录的那样。

原文链接：  

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33725513/

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